提到达芬奇，我们就会想到他著名的作品《蒙娜丽莎》。《蒙娜丽莎》带着迷人而神秘的微笑，并且这幅画上面没有签字，没有日期，更没有透露画中人的名字，这引起了人们无限遐想。很多人认为，她可能是当时意大利社会名流伊莎贝拉·德艾斯特、伊莎贝拉·古亚兰达或塞西利娅·加莱拉妮；也有一些人认为原型是达芬奇的情妇，还有人说她是一个妓女；有人认为原型是达芬奇的母亲；还有人对达芬奇的面部线条与画中人的面部线条进行了对比，认为二者非常相似，于是得出结论：这是达芬奇的自画像，他把自己画成女人，因为他天性好玩；有人据此认为，达芬奇是同性恋。
“**者”的指控是达·芬奇一生的隐痛。1476年，他被控与17岁的男模特发生关系，在两次听证会后，这案子因为证据不足而不了了之。这次审判无疑给达·芬奇带来了巨大的心灵创伤，之后的岁月里，他竭尽所能保护自己的私生活，甚至用倒写法隐藏真实思想。所以，一切关于他是同性恋的猜想都停留在捕风捉影的阶段。
这是有据可查的直接证据，间接证据也有很多。
人们认为达·芬奇一生没有结婚是最大的疑点，并且无任何资料显示他热恋过哪位女性。
1910年，身为精神病学医生的犹太学者弗洛伊德，出版了一部题为《列奥纳多·达·芬奇和他童年的一个记忆》的论文。在这篇论文
中，弗洛伊德从心理分析的角度阐释了达·芬奇性取向的成因，做出了“达·芬奇是同性恋者”的结论。
在达·芬奇的作品中，确实有很多男女界限不分明的形象，比如在《施洗者圣约翰》这幅作品中，达·芬奇把圣约翰的脸画得十分柔美，如果光看面庞，人们很难断定画中人的性别。
长期以来，人们对此津津乐道。许多历史学家指出达芬奇倾向于男性，他一生从未与任何女人有过亲密关系，他的画作也证明了他对男性美的迷恋。他的素描基本上只针对男性**，对性器官的描绘尤其引人注意，而与之形成鲜明对比的是，他很少画到女人脖子以下的部分，即便画了，性器官也非常模糊甚至扭曲。
另外，达·芬奇笔记本里的许多注释暗示了他与男学生Gian Giacomo de’Caprotti的暧昧关系，据说这关系持续了20年。达·芬奇去世前不久完成的画作《施洗圣约翰》美丽却妖冶，画中那男女莫辨的圣约翰原型就是Caprotti。
1910年，弗洛伊德利用达·芬奇的笔记作为原材料对其性取向进行了深入研究。他认为，达·芬奇将他的性欲表达在作品中，许多未完成的作品便是一种性挫败的象征。
而时下风靡全球的《达芬奇密码》里不止一次的公然承认达芬奇是个同性恋者。500多年前，达·芬奇在他的手稿中使用了一种奇特的文字，这种文字像一种密码，令许多人困惑。经过语言学家的努力，终于破译了这些“密码”。原来，达·芬奇在手稿中使用的这些文字实际是用左手写出来的反字。
达·芬奇在去世之前，把手稿上奇怪文字的秘密告诉了他最信任的学生梅尔茨。达·芬奇此举有着自己的打算，如果他的手稿在有生之年没能出版，他想把多年潜心研究并精心绘制的手稿交给梅尔茨，由他帮助自己整理后出版。
梅尔茨忠厚老实，在达·芬奇晚年一直陪伴在他的左右。
有一天，达·芬奇把梅尔茨单独叫到了一旁，悄悄地对他说：“知道吗，要想读懂我的手稿，你就得这样……对着阳光，把纸翻过来看就行了。”
梅尔茨顺着老师的手望去，一排排熟悉而又清楚的文字跃然纸上。他对老师的这种奇特才能赞叹不已，而达·芬奇却示意他不要声张，因为他只把这个秘密告诉了梅尔茨一个人。
梅尔茨果然是个忠诚的人，在他生前，不仅完好地保存了达·芬奇的全部手稿，还严密地保守着如何阅读达·芬奇手稿的秘密。然而，梅尔茨虽然忠诚，能力却很一般，他虽然倾尽全力，但只整理出一部未完成的《绘画论》，这是达·芬奇留给后人的唯一著作，并且还是在梅尔茨去世后才得以出版的。．
更为不幸的是，梅尔茨的儿子奥拉奇奥对达·芬奇原始手稿的价值一无所知。他或是把手稿随意地抽出送人，或是零散地从笔记本上撕下来卖掉，以获取蝇头小利。已经知道如何阅读达·芬奇手稿的奥拉奇奥，顺便将读解这些特殊文字的秘密泄露给了别人。
现在，不少人正热衷于研究这些“达芬奇密码”，希望能从中找出关于达芬奇更多的秘密，其中就包括达·芬奇是不是同性恋这个问题。根据他的画如《最后的晚餐》里的圣约翰和《施洗者》的圣约翰，脸都画的很柔美，要是不看他们的体态的话，是比较女性化的脸的。说明他对男女的分界线很模糊。而他究竟是不是同性恋，我们不得而知。